Institut für Angewandte Physiologie

Funktionelle Einzelzell-Genexpressions Analyse am Beispiel dopaminerger Neuronen

 

Praktikum Laser-Mikrodissektion und Primerdesign für RT-PCR Genexpressionsanalyse

(Stand: 13.07.06)

Bitte vor Praktikumsbeginn diese Unterlagen sorgfältig durcharbeiten, und auch Prinzip der RT-PCR auffrischen (siehe auch Methodenlinks).

Dias aus der allgemeinen Einführungsvorlesung vom 19.05.06 hier als PDF.

 

1. Praktikumsziel:

 

2. Praktische Aufgaben:   

    2.1  Laser-Mikrodissection einzelner dopaminerger Neuronen aus Hirnschnitten (Maus): Im Labor AG Liss 

    2.2  PCR-Primerdesign für eine RT-PCR Genexpressionsstudie (Maus): Im Computerraum der Physiologie.

3. Methoden/Techniken (Links):

    Schema zum Design einer RT-PCR Expressionsstudie:
    Animationen zum Prinzip der RT-PCR Methode
    Infos zur Laser-Mikrodissektion: PALM-Gerät / Leica LMD6000

Maus Brain Atlas - Mittelhirnschnitt coronar, Substantia nigra

Maus Brain Atlas - Allan Institute: in situ Genexpressionsatlas

Weiterführende Links

    Infos zu allen gängigen Molekularbiologie Methoden (auch Mikroarrays)
    Informationsportal zur Methode der real-time quantitativen PCR
    Informationen zur Patch-Clamp Technik
    Animation zur Patch-Clamp Technik

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1. Praktikumsziel:

Das Humane Genom Projekt sowie weitere Genom-Sequenzier Projekte anderer Organismen liefern eine unübersichtlich grosse Menge von Gen-Informationen.
Diese Daten sind z.B. mit Hilfe des Internets aus verschiedensten Datenbasen in unterschiedlichen Formaten für jedermann jederzeit abrufbar. Die Masse dieser Dienste und Datenbanken sind (noch) kostenfrei.

Im Rahmen dieses Ein-Tages Praktikums soll ein Einblick gegeben werden, auf welche Weise diese Daten im Forschungsalltag benötigt und genutzt werden.
Im Speziellen soll erlernt werden, welche Datenbanken und Geninformationen zur Verfügung stehen, und wie die jeweils relevanten Informationen aus der Fülle der Datenmengen extrahiert werden können, um zB zellspezifische Genexpression mittels RT-PCR (Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction) zu analysieren.

Die Praktikumsteilnehmer sollen dazu in 2er/3er Gruppen selbständig nach Vorgabe ein geeignetes PCR-Primer-Set (forward/reverse) für eine quantitative RT-PCR designen und am Ende des Tages Ihre Ergebnisse im Rahmen eines Kurzvortrags präsentieren.

Sie werden feststellen: es sind sehr viele Informationen im Netz vorhanden, teilweise aber auch unstrukturiert und fehlerhaft, da im Prinzip jeder ungeprüft DNA-Sequenzen in die Datenbanken eingeben kann. Daher kann es viele verschiedene Wege geben, um die gewünschten Informationen für ein jeweiliges Gen zu erhalten."Der Weg ist das (Praktikums-) Ziel".

Im 2. Teil des Praktikums soll die Laser-Mikrodissectionstechnik (LMD) erlernt werden, die es erlaubt, einzelne Zellen kontakfrei aus Gewebeverbänden (z.B. Gehirn) zu isolieren.
Es ist geplant, dass die Praktikums-Teilehmer - unter Anleitung (Gerät ist sehr wertvoll und empfindlich) und mit Hilfe eines Maus-Brain-Atlas - selbstständig einzelne dopaminerge Neurone in fixierten koronalen Maus-Hirnschnitten identifizieren und mittels Laser-Mikrodissektion isolieren. Die Durchführung dieses Teils hängt von den zZ in unserem Labor laufenden Experimenten bzw. freien Kapazitäten ab.

Darüberhinaus werden je nach Zeit/Wunsch die Forschungsschwerpunkte der Arbeitsgruppe Molekulare Neurobiologie vorgestellt, welche mittels Einzelzell RT-PCR Genexpressionsanalyse untersucht werden.

2. Praktische Aufgaben:

Bitte für die Abschlussbesprechung über die "Warum?" Fragen an den jeweiligen Stellen nachdenken, und Ihre Antworten, Probleme und individuellen Lösungswege skizzieren.


2.1  Teil B: Laser-Mikrodissection (LMD) einzelner dopaminerger Neuronen aus Maus-Hirnschnitten:

Ziel dieses Praktikumsteils ist es, dass Sie alle mit dem Gerät erfolgreich einzelne dopaminerge Neurone im koronalen Hirnschnitten der Maus identifizieren, diese mittels LMD isolieren, und anschliesend die gelaserte Zelle im Reaktionsgefäss wiederfinden können.

  • Cresyl-violett gefärbte coronale Maus-Hirnschnitte werden von uns zur Verfügung gestellt.
  • Die Benutzung des Laser-Mikrodissektionsgeräts wird vor Ort genau erklärt. Bitte nur in Anwesenheit eines Betreuers daran arbeiten und im Zweifel immer Betreuer um Hilfe fragen - das Gerät ist sehr teuer (>100.000 EUR) und es gibt kein zweites dieser Art in Marburg...
  • Was passiert wenn man die Laserenergie erhöht oder erniedriegt? Was passiert, wenn man den Focus des Lasers verändert?



2.2 Teil A: PCR-Primer Design zur RT-PCR Genexpressionsanalyse für Maus:

Ziel dieses Praktikumsteils ist es, dass Sie die Grundprinzipien für die Auswahl von RT-PCR Primern verstanden haben, dass Sie wissen, welche Datenbanken dazu zu benutzen sind, und wie man generell mit diesen arbeitet.
Am Praktikumsende soll jede Gruppe gemeinsam das ausgewählte Primerpaar für Ihr Gen vorstellen bzw den Weg der Primerwahl diskutieren - auch hier gilt: der Weg ist das Ziel.

  • Gruppe 1:    vGlut2 = SLC17A6 = vesicular glutamate transporter 2.
  • Gruppe 2:    vGlut3 = SLC17A8 = vesicular glutamate transporter 3.
  • Gruppe 3:    EphA5 = Ephrin-Rezeptor subtyp A5.
  • Gruppe 4:    EphB1 = Ephrin-Rezeptor subtyp B1.

       Species: Maus = "mus musculus" für alle 4 Gene bzw Gruppen .

Folgendes Schema soll Schritt für Schritt (I-IV, in dieser Reihenfolge!) für das jeweilige Gen ausgeführt werden:
Detaillierte Infos zur Durchführung und Benutzung der jeweiligen Datenbanken/Programme finden Sie unter Punkt 3.
Bitte hier erst einmal lesen - dort sollten Sie alle Infos finden, die Sie benötigen.

I. Welche Funktion hat das zu untersuchende Gen bzw das Genprodukt? Gibt es alternative Namen? (OMIM, Gencards), siehe auch Punkt 3.1
II. Auffinden der cDNA Sequenz (NCBI Nucleotide) und der genomischen Struktur i.e. die Intron/Exon Übergänge (Ensemble): siehe auch Punkt 3.2
  • Entscheidung für einen NCBI Sequenz-Eintrag, da in der Regel mehrere, teils unterschiedliche Genbankeinträge für das selbe Gen zu finden sind.
  • Aufschreiben der individuellen NCBI "Accession number" (spezif. Identifikationsnummer für jeden einzelnen Genbankeintrag, ermöglicht auch, die Sequenz in anderen Datenbanken wiederzufinden). 
  • Speichern der Accession-Nummer spezifischen NCBI cDNA Sequenz einmal im Genbank-Format (beinhaltet Textinfo) und einmal im Fasta-Format (reine DNA Sequenz). Ausdrucken bitte nur das Genbank-Format.
  • Einzeichnen von Start- und Stopp-Codon, sowie von mindestens einem Intron/Exon Übergang in den Genbank NCBI cDNA Sequenz Ausdruck (warum?).
III. Gibt es weitere Gen-Familienmitglieder oder homologe Gene oder Pseudogene (Was ist das?) mit ähnlicher cDNA Sequenz? Infos dazu  in OMIM, Gencards - auch Blast search kann helfen.
  • Wenn ja, Multiple Sequence Alignment (MSA) der homologen (=verwandten) Gene, um ähnliche  DNA Bereiche zu identifizieren (Warum ist dies wichtig?).
  • Für das Praktikum ist es ausreichend, wenn Sie nur ein homologes Gen mit Ihrem Zielgen per MSA untersuchen, und zwar vGlut2 und vGlut3 bzw EphA5 und EphB1: die 2. dazu benötigte cDNA-Sequenz bzw Accession number können Sie sich von Ihrer jeweiligen Partnergruppe (1/2 sowie 2/3) geben lassen.
IV. Auswahl geeigneter, Gen-spezifischer PCR-Primer:
  • Einlesen der cDNA Sequenz in das Primer-Design Programm (Primer3), genaue Angaben zu den Programmeinstellungen siehe Punkt 3.3
  • Auswahl je eines geeigneter Vorwärts (Forward, F, sense) und Rüchwärts (Reverse, R, Antisense-, Gegenstrang-) Primers:
  • Das resultierende PCR Fragement soll zwischen  50-100 bp gross sein (warum?) und mind ein Exon/Intron-Übergang beinhalten (warum?).
    • <>Überprüfen der Spezifität der ausgewählten Primer durch Genbankabfrage (BLAST "short sequence search"):
    Insbesondere das 3' Ende (die letzten 5 Basen) des Primers, an dem die Taq-Polymerase bindet, sollte sehr spezifisch für das Zielgensein, und keine anderen Gene derselben Species (als Maus) erkennen (Warum?).
  • Auffinden/Eintragen der Primersequenzen in den NCBI cDNA Genbank-Sequenz Ausdruck: Beachte: der Reverse (R) Primer wird auch in 5' - 3' Sequenz vom Primer Programm ausgegeben, muss also in der Genbank-Sequenz reverse complement (umgekehrt und rückwärts) gelesen/gesucht werden!
           

3. Schema zum Design einer RT-PCR Expressionsstudie:

    3.1   Informationssammlung für das zu untersuchenden Gen
    3.2   Auffinden der cDNA und DNA Sequenzen (Intron-Exon)
    3.3   Auswahl eines geeigneten PCR Primerpaars für eine RT-PCR Analyse

3.1 Informatiossammlung für das zu untersuchende Gen
  • Auswahl des / der Gene, deren Expression untersucht werden soll (fürs Praktikum: Gruppeneinteilung siehe oben).
  • Was ist über die Funktion und Expression des Gens/Genprodukts bekannt? Sind assoziierte Krankheiten beschrieben?
  • Versuche, möglichst viele Informationen über das Gen herauszufinden: z.B. Basenlänge, Genvarianten, Chromosomale Lokalisation, gibt es Splicevarianten, Pseudogene, (Was ist das geanu?) homologe/verwandte Gene?

Datenbanken für Gen-Info Suche:

Alle Datenbanken erfordern Keywordeingaben wie generell in Suchmaschinen zum Datenauffinden, zwei Suchworte werden mit grossgeschriebenen "AND" verbunden: z.B "Genname AND mouse"

 i. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIMNCBI OMIM
"Online Mendelian Inheritance in Men": viel Textinfo zum Gen/Produkt, "Steckbrief", wenig DNA-Info. Idealer Startpunkt zum Einlesen.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM

 ii. http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/Gene Cards
wenig Text, viel DNA/Gen-Infos, viele Links direkt zu anderen Datenbanken teilweise, komplex zu verstehen, mann muss sich hier Zeit nehmen.
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/

iii. NCBI PubMed/Medline
Originalliteratur/Reviews für tiefergehende Infos, nicht für das Praktikum relevant.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

3.2 Auffinden der cDNA Sequenzen und Intron/Exon Übergänge
  • Auffinden der cDNA-Sequenz für das zu untersuchende Muas-Gen mittels "NCBI Nucleotide Search": Auswahl eines individuellen Eintrags/einer Accession-Number. Diese Nummer findet sich meistens unter Punkt 3 des Genbankeintrags. Datum des Genbankeintrags: oben rechts. Entscheidungshilfe: Accession-Nummern, die mit "NM.. " anfangen sind meist die aktuellsten, die schon mehrfach überprüft wurden.
  • Nur mit einem spezifischen Genbankeintrag dann weiterarbeiten. (Warum wichtig?).
  • Speichern und ausdrucken der NCBI Sequenz im Format „Genbank“ zur Ansicht, in Format „Fasta“ zum Bearbeiten/Einlesen in weitere Programme: Formate können unter der NCBI Maske im "Display" Menüpunkt geändert werden.
  • Auffinden der Exon/Intron Übergänge ist am einfachsten mit dem "Ensemble" Programm (s.u. link). Idealerweise für die jeweilige Spezies (Maus). Sollte diese einmal nicht auffindbar sind, entsprechend verwandte Spezies nehmen – (Maus/Ratte/Human), da die Übergänge meist hochkonserviert sind (Warum?). 
  • Beachte: die Gensequenz-Einträge in NCBI und Ensemble sind nicht immer identisch. Sequenzen beginnen unterschiedlich und können leicht unterschiedliche Sequenzen aufweisen. Zum "Wiederfinden" der Intron/Exon Übergänge hilft es daher, sich jeweils Start (ATG) und Stop Codon der Codingsequenz (CDS) anzeigen zu lassen bzw einzuzeichnen!


Datenbanken zum Auffinden von DNA Sequenzen:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide i. NCBI Nucleotide:
Am besten geeignet zum Auffinden von Gen cDNA Sequenzen - individueller Accession Number:
Keyword Eingabe "cDNA AND Suchwort" führt zur cDNA (bzw genomischen DNA Sequenz) - auf Species achten!
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide

ii. Ensemble, Sanger Centre
Sehr gut geeignet zum Auffinden von Intron/Exon Informationen:
Auswahl der Species (Maus), dann Keywordeingabe oder NCBI Accession number. In der "Transcript" Information/Ansicht, werden die unterschiedlichen Exone der cDNA Sequenz abwechselnd blau und schwarz dargestellt. Hilfreich und zu empfehlen: Basenpaar-Nummerierungen sowie (Start- Stop-)Codonlage und AS-Sequenz können zusätzlich angezeigt werden.
http://www.ensembl.org/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

iii. MSA Mulitple Sequence Alignment at BCM Search Launcher:
Erlaubt den direkten Sequenzvergleich von 2 und mehr DNA Sequenzen:
Einkopieren der zu vergleichenden Sequenzen im "Fasta-Format" mit der 1. Kopf/Text-Zeile untereinander mit Leerzeile.Wähle das Programm „MAP“ nicht „ClustalW“.

Das Ergebnis kann mittels "Boxshade-Programm" optisch ansprechender dargestellt werden (Anleitung dazu ganz am Ende des erhaltenen MAP-Alignments. Für Boxshade-Output format "RTF_new" wählen).
http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html

iv. NCBI Blast search:
Auffinden von Homologen - ähnliche und verwandte Gensequenzen: Für das Praktikum nicht erforderlich (siehe unter 2 Punkt III)
Wähle "Standard nucelotide-nucleotide search [blastn]". Einlesen der cDNA Sequenz: "Fasta" Format ohne die 1. Kopf/Text-zeile. Spezies kann eingeschränkt werden auf "Mus Musculus" =Maus (was bewirkt dies?).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

3.3 Auswahl der PCR-Primerpaare für eine RT-PCR Analyse
1.  Auswahl des generell möglichen Gensequenz-Bereichs, in der die Primer liegen sollen:
  • Bei Genfamilien: Multiple Sequenz Alignment (MSA) der Genfamilien-Mitglieder/Splicevarianten, um homologe Bereiche zu identifizieren. Sollen genspezifische Primer gefunden werden: Primer in nicht-homologe Bereiche legen (besonders der 3’ Bereich des Primers soll spezifisch nur das Zielgen binden).
  • Das von einem Primerset amplifizierte DNA-Fragment sollte mindestens ein Intron/Exon Übergang beinhalten, da dann mögliche genomische Kontaminationen anhand Ihrer Grösse identifiziert werden können (grösseres PCR-Fragment im Agarosegel).
2.  Auswahl der Primer mittels Primerdesign-Software "Primer 3":

Einlesen der cDNA Sequenz in das Primerdesign-Programm (im „Fasta“ Format mit oder ohne die Kopf/Textzeile. Einfügen mit "Copy&Past Funktion").
Auswahl der Primerparameter/Kriterien, Software-Einstellungen:
  • Mispriming Library (repeat library): Wähle "RODENT_AND_SIMPLE" (Was bewirkt diese Wahl?).
  • "Sequence ID": Gebe den Primersuchauftrag einen Namen (zB "Praktikum-Genname").
  • "Excluded regions": Wo soll kein Primer liegen? (Ausschluss von Homologiebereichen mit Genfamilien-Mitgliedern (MSA!).
  •  "Targets": Wo soll ein Primer liegen (in nicht-homologen Bereichen, ein Intron/Exon Übergang soll zwischen beiden Primern liegen.
  • "Product size range": PCR-Fragmentgrösse zwischen 50-100 bp für real-time PCR, optimal für anschliessende Gelelektrophorese: 250-600 bp. (Warum unterschiedlich?)
  • "Primer Size" (= Länge): 20 Nukleotide, "Primer Tm" (Annealing-Temperatur): 59.7-60.3, Optimum: 60.0 oC, "GC-Content": 40-60%, Optimum: 50%, "number to return": 20 forward/reverse. (Was bestimmt der jeweilige Parameter?)
  • Welche Einstellungen können noch geändert werden? Welche Auswirkungen haben diese auf die Primerauswahl?
  • Auswahl eines geeigneten Primerpaars aus allen von der Software ausgegebenen Primer-Liste
          
4.  Überpüfung der Primer-Spezifität:

Um sicherzustellen, dass die Primer nur spezifisch die gewünschte Gensequenz binden und amplifizieren, werden die ausgewählten Primer (F/R)  mit einer Datenbank verglichen, die alle zur Zeit identifizierten Gensequenzen enthält: Blast-Search.
  • Wähle beim Blast-Programm (s.u.) “Search for short, nearly exact matches”:
  • Einlesen mit "Copy & Paste", Leserichtung/Orientierung egal. Prüfen von jeweils einer Primersequenz pro search (NICHT beide auf einmal einlesen).
  • Für das Praktikum: Suchen Sie im Blast-Ergebnis nur nach anderen definierten Maus- oder Rattengenen, an die der Primer bindet, undefinierten Clone oder Gewebesequenzen bitte ausser Acht lassen.
  • Insbesondere die letzten 5 Basen am 3'-Ende des Primers bestimmen die Spezifität (da hier die Taq-Polymerase binden muss für PCR Amplifikation). Hier ist eine hohe Spezifität besonders wichtig.
  • Ergeben sich hohe Homologien auch mit anderen Genen derselben Spezies, so ist der Primer nicht geeignet (Warum?). Das Abschätzen erfordert Übung - es gibt keine absoluten Regeln/Kriterien.

      Datenbanken zur Primerauswahl:

       i. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgiPrimerselection: Primer3
      Einkopieren der cDNA-Gensequenz im Fasta-Format, Einstellungen: siehe oben
      http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

      http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ii. Blast Search at NCBI:
      Wähle: “Search for short, nearly exact matches”. Einschränkung fuer Organism (Species) "Mus musculus" (Maus): Einkopieren jeweils einer der zu  überprüfenden Primersequenz.
      http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/