Kryo Präparationen
Elektronenstrahlen können nur dünne Schichten (< 1 µm) durchdringen, ohne unkontrolliert abgelenkt zu werden. Die zu untersuchenden Objekte müssen also entweder sehr dünn geschnitten werden zur Analyse im Transmissions-Elektronenmikroskop, oder die relevanten Strukturen müssen an der Oberfläche der Probe exponiert sein zur Untersuchung im Raster-Elektronenmikroskop. Bei wasserhaltigen biologischen Strukturen ist keines von beidem direkt möglich, sie werden üblicherweise chemisch fixiert, in ein Harz eingebettet und dann ultradünn geschnitten oder chemisch fixiert und anschliessend schonend getrocknet für das Raster-Elektronenmikroskop. Beide Verfahren sind nicht möglich, ohne dass sich die Probe verändert und Artefakte eingeführt werden.
Eine Alternative dazu sind Kryo-Präparationen. Mit der Kryo-Fixation kann ein physiologisch definierter Zustand schnell eingefroren und untersucht werden. Ist die Probe einmal gefroren, verhält sie sich wie ein Festkörper, und kann relativ kontrolliert aufgebrochen oder aufgeschnitten werden. Als wichtiges erstes Glied der Kryo-Präparationskette ist dazu in der Sektion Elektronenmikroskopie ein Hochdruckgefrier-Apparat angeschafft worden. Er dient zum Einfrieren (Kryofixieren) von kleinen Gewebe- und Zellkulturproben (Dicke bis ca. 200 µm, Durchmesser bis ca. 2 mm) ohne chemische Vorbehandlung und ohne störende Eiskristallartefakte (Studer et al., 1989, Buser und Walther, 2008). Hochdruckgefrieren ermöglicht somit die Fixation der Proben in einem physiologisch definierten Zustand. Die Immobilisation ist dabei wesentlich schneller (10 bis 100 Millisekunden) als bei konventioneller chemischer Fixation (Sekunden bis Minuten), was die Artefaktbildung reduziert. Es konnte in zahlreichen Arbeiten nachgewiesen werden, dass kryofixierte biologische Proben besser den in-vivo Zustand beschreiben als chemisch fixierte (Shimoni et al., 1998; Szczesny et al., 1996; Kaneko und Walther, 1995 , Buser und Walther, 2008 und andere).
Unser Hochdruckgefrier-Apparat an der Uni Ulm ist seit März 1999 im Betrieb. Seit Sommer 2003 benutzen wir einen neuen Hochdruckgefrierer. Zur Zeit werden die meisten Proben nach der Hochdruck-Kryofixation gefriersubstitutiert. Bei dieser Methode werden die gefrorenen Proben bei tiefen Temperaturen entwässert und chemisch fixiert. Solche Präparate können dann konventionell eingebettet und geschnitten werden. Ein altes Problem ist dabe die gute Sichtbarkeit der Membranen (Walther und Ziegler, 2002)
Für viele Fragestellungen ist es aber besser, die gefrorenen Proben direkt im Kryo-Raster-Elektronenmikroskop zu analysieren (Übersichtsartikel von Echlin, 1978 , Walther, 2008), weil dabei Entwässerung und Einbettung und damit verbundene Artefakte entfallen und weil dabei sämtliche Komponenten in der Zelle erhalten werden können, wie z. B. diffusible Ionen. Da die Probe im Raster-EM nicht durchstrahlt werden muss, braucht sie nicht besonders dünn zu sein, es genügt also, eine gefrorene Probe aufzubrechen oder aufzuschneiden und mit einer geeigneten Metallschicht zu versehen. Diese vereinfachte Präparation funktioniert nun auch für Proben, bei denen es schwierig ist, Replikas für das Transmissions-EM herzustellen, sei es, weil die Proben zu grossflächig und zu stark dreidimensional strukturiert sind (Weisbach et al., 1999), und somit die Stabilität der Replika zu gering ist, oder sei es, dass sich die Replika schlecht reinigen lässt, weil sich das Probenmaterial nicht entfernen lässt (Walther und Müller, 1997). In meiner letzten methodischen Arbeit (Walther und Müller, 1999 in press) wurden die Proben nicht aufgebrochen, sondern im Kryo-Ultramikrotom aufgeschnitten was einen gänzlich neuen ultrastrukturellen Aspekt ergibt. Aktuelle fortschritte sind publiziert unter Walther, 2003a und Walther, 2003b.
Normale Elektronenmikroskopische Abbildungen sind zweidimensionale Bilder einer dreidimensionalen Probe. Dabei geht viel Information verloren z. B. über die Zusammenhänge der Membransysteme. Mit Elektronen-Tomographie werden dreidimensionale Datensätze von bis zu 500 nm dicken Schnitten erhalten. Ein für die Tomographie geeignetes 300 kV TEM ist im Jahre 2002 im HBFG-Verfahren von Paul Walther erfolgreich beantragt worden und konnte im Jahre 2005 dann endlich beschafft werden. Damit werden die Ausschleusung und Membranumhüllung von Cytomegalieviren und Exocytosevorgänge im Pankreas dreidimensional untersucht (In Zusammenarbeit mit der Abteilung Virologie im Schwerpunktprogramm 1175 und im Projekt A15 und B20 im SFB 518).