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Methoden zur Erythrozytenserologie
KryoBeads method(PVP beads or KryoHAES beads)
Die "Kügelchen"-Methode(PVP-Kügelchen oder KryoHAES-Kügelchen)
These neat video clips document the whole process of the KryoHAES procedure starting from the preparation step, going through the bead freezing process and ending with the thawing and recovery of the red blood cells.
For rapid viewing, check videos 4, 5 and 6 first.
All video clips are provided in mpg-format.
1 RBC preparation 2.3 MB
2 RBC mixing 7.1 MB
3 droplet freezing process 2.7 MB
4 droplet freezing continued 2.1 MB
5 droplet harvesting 3.9 MB
6 droplet thawing and RBC recovery 5.0 MB
Videos were provided by Dr E K Petershofen at the Institut Oldenburg of the DRK Blutspendedienst NSTOB, Springe, Germany, which is hereby acknowledged. State this source of these videos, if you will be using them for teaching purposes and otherwise.
Die Video-Clips zeigen den gesamten Vorgang des KryoHAES-Verfahrens beginnend mit den Vorbereitungen, gefolgt von dem Einfrieren der Kügelchen bis hin zum Auftauen und der Rekonstituierung der Erythrozyten.
Zum schnellen Anschauen, betrachten Sie bitte zuerst die Videos Nr. 4, 5 und 6.
Alle Video-Clips sind im mpg-Format online abrufbar.
1 Erythrozyten vorbereiten 2.3 MB
2 Erythrozyten mischen 7.1 MB
3 Vorgang des Einfrierens 2.7 MB
4 Kügelchen einfrieren (Fortsetzung) 2.1 MB
5 Kügelchen sammeln 3.9 MB
6 Kügelchen auftauen und Erythrozyten rekonstituieren 5.0 MB
Die Video-Clips wurden von Herrn Dr E K Petershofen am Institut Oldenburg des DRK Blutspendedienstes NSTOB in Springe zur Verfügung gestellt, wofür ihm gedankt sei. Geben Sie diese Quelle an, wenn Sie die Video-Clips für Schulungszwecke oder anderweitig benutzen.
Principle
HES and PVP are non-penetrating cryoprotective agents. RBC can
be frozen directly in liquid nitrogen, once suspended in PVP or HES.
Since both cryopreservants do not penetrate the red cell membrane,
RBC can be recovered after storage in isotonic salt solution (e.g. PBS) without
elaborate washing procedures.
Freezing
1. centrifuge RBC to remove supernatant, wash if required
2. prepare freezing solution: 2.3 ml PVP 30% plus 2.7 ml BSA
3. add RBC to freezing solution at 1:1 ratio
4. let sit at room temperature for 10 min
5. drip RBC/cryopreservant mixture dropwise into liquid nitrogen in a sequential
manner
6. pure off liquid nitrogen for easy removal of frozen droplets
7. put droplets into 1.5 ml freezing tubes
8. For long term storage, transfer into liquid nitrogen barrel
or -80 °C freezer
Thawing
1. Drop one or more frozen beads into e.g. 1 ml isotonic salt
solution at room temperature.
2. Finished.
3. Only if required, wash and suspend at a given concentration.
Prinzip
HAES und PVP sind nicht membrangängige Gefrierschutz-Reagenzien. Erythrozyten
können direkt in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, wenn
sie in PVP oder HAES suspendiert wurden.
Da beide Gefrierschutz-Reagenzien nicht in die Erythrozyten eindringen,
können die Erythrozyten nach der Lagerung direkt in physiologischer
Kochsalzlösung aufgetaut werden, ohne dass sich Waschschritte anschließen
müssen.
Einfrieren
1. Erythrozyten-Suspension zentrifugieren, um Überstand
zu entfernen, falls erforderlich waschen
2. Gefrierlösung herstellen: 2,3 ml PVP 30% plus 2,7 ml
BSA
3. Erythrozyten mit Gefrierlösung im Verhältnis 1:1
mischen
4. bei Raumtemperatur für 10 min stehen lassen
5. Mischung aus Erythrozyten und Gefrierlösung tröpfchenweise langsam
in flüssigen Stickstoff tropfen lassen
6. flüssigen Stickstoff abschütten, um gefrorene Kügelchen
einzusammeln
7. Kügelchen in 1,5 ml Gefriergefäß mit Schraubverschluss
überführen
8. für längere Lagerung (mehr als 3 Monate) in Fass mit Flüssigstickstoff
überführen oder in -80 °C Kühltruhe geben
Auftauen
1. Ein oder mehrere gefrorene Kügelchen in z. B. 1 ml physiologische
NaCl-Lösung (Raumtemperatur) fallen lassen.
2. Fertig.
3. Nur falls erforderlich, waschen und auf bestimmte Konzentration
einstellen.
HAES solution
as provided by manufacturer
333 ml H2O warm in Erlenmeyer glas bottle, but do not boil
keep steering with magnetic fish
add total of 100 g PVP in 10 g steps, takes about 3 - 4 hrs
use polyvinyl-pyrrolidon (PVP K 30, Roth, Karlsruhe no. 4607.2, mol.weight 40,000)
distribute into 20 ml aliquots in glas flasks
autoclave
store at room temperature in dark
An extensive report on droplet freezing technique for the cryoproservation of RBC is given in: Pegg DE, Diaper MP, Scholey SEG, Coombs RRA, Droplet freezing of antibody-linked indicator red cells of shepp, ox, and human origin, Cryobiology 19(1982)573-584 .
The helpful discussions with A Sputtek and H Hustinx at the occassion of the annual meeting of the German Rare Donor Program in Berlin, 26 May 2003, are acknowledged. Parts of the method were adopted from the International Blood Group Reference Laboratory at Bristol, laboratory of Joyce Poole .
RBC freezing (
high glycerol method
, 38%)
Sponsored by the DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg - Hessen gGmbH, Mannheim