Forschung und Entwicklung 2002

 

 

Bezeichnung der Arbeitsgruppe

Molekulare Genetik von Blutgruppen

 

DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen, Institut Ulm

Abteilung Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Ulm

 

 

Zusammensetzung der Arbeitsgruppe

Arbeitsgruppenleiter: Priv.-Doz. Dr. med. Willy A. Flegel

Stellvertretender Arbeitsgruppenleiter: Priv.-Doz. Dr. med. Franz F. Wagner

Postdoktorand: z. Zt. keine

Doktorand: cand. med. Fabricio Lupo

Doktorand: cand. med. Marco Neß

Doktorand: cand. med. dent. Oliver Dolp

Technische Assistentin: Marianne Lotsch

 

 

Bezeichnung der derzeit durchgeführten Projekte

1.         Aufklärung des Allel-Polymorphismus im Rhesus-Blutgruppensystem

2.         Charakterisierung des RH-Genorts auf dem menschlichen Chromosom 1

3.         Nationale Qualitätssicherung der derzeit empfohlenen Rhesus-Typisierungsstrategie

4.         Molekulare Basis von Blutgruppen-Systemen

5.         Entwicklung praxisgerechter Verfahren zur Genotypisierung von Blutgruppen

6.         Durchfluss-Zytometrie zur Beschreibung des Erythrozyten-Phänotyps

 

 

Beschreibung der derzeit durchgeführten Projekte

 

Übersicht:

 

Die Arbeitsgruppe „Molekulare Genetik von Blutgruppen“ untersucht die Membranproteine des Erythrozyten, um die Zusammenhänge von Genotyp, Phänotyp, Struktur und Funktion zu klären.

 

 

Einzelprojekte:

 

1.         Aufklärung des Allel-Polymorphismus im Rhesus-Blutgruppensystem

 

Die Rh-Blutgruppe („Rhesusfaktor“) ist das komplizierteste Blutgruppensystem. Die Kenntnis der in diesem Blutgruppensystem auftretenden Allele und ihrer Phänotypen ist Voraussetzung für eine rationale und kostengünstige Typisierungsstrategie in der immunhämatologischen Routine. Die enorme praktische Bedeutung ergibt sich alleine daraus, dass jede Blutgruppenbestimmung eine Bestimmung des Antigens D umfasst.

 

Blutproben von Patienten und Spendern werden mit molekularbiologischen und serologischen Methoden systematisch untersucht. Ziel ist eine möglichst vollständige Beschreibung der gefundenen Allele mit Angaben zu ihrer Häufigkeit, ihrem serologischen Phänotyp, dem Verhalten in den derzeit üblichen Typisierungsverfahren sowie einem möglichen Immunisierungsrisiko. Die Arbeitsgruppe erhält in erheblichem Ausmaß internationale Einsendungen und etwa ein Drittel aller weltweit bekannten RHD-Allele sind von ihr beschrieben worden. Insbesondere wurden fast alle bekannten weak D-Allele in Ulm charakterisiert (vgl. die folgende Abbildung).

 

Ein Meilenstein im Jahr 2002 war die Entdeckung der 5 DAU-Allele, die zu den bei Afrikanern am häufigsten auftretenden Partial D-Allelen gehören und einen eigenen Ast im menschlichen Stammbaum der RHD-Allele bilden. Dieses Verständnis der Vielfalt und Verteilung der RHD-Phänotypen erlaubt verlässliche Vorhersagen zu den in unterschiedlichen Populationen bei der D-Typisierung zu erwartenden Problemen. Die in Ulm entworfene Routine-Typisierung für Rhesus ist das seit 1996 in den deutschen Richtlinien empfohlene Verfahren und ist später in mehreren europäischen Ländern übernommen worden. Die Absicherung dieses Verfahrens durch die Klärung des RHD-Stammbaums wird zur Akzeptanz auch in den USA beitragen.

 

 

2.         Charakterisierung des RH-Genorts auf dem menschlichen Chromosom 1

 

Der RH-Genort („RH-Locus“) umfasst die beiden Gene RHD und RHCE sowie das zwischengelagerte Gen SMP1. Die Struktur wurde im Jahr 2000 im wesentlichen von der Arbeitsgruppe in Ulm aufgeklärt. Derzeit wird im Rahmen einer Doktorarbeit die Variabilität dieser Struktur bei unterschiedlichen Allelen und Populationen evaluiert. Aktuell wurden die Ereignisse bei der Verdopplung der RH-Gene veröffentlicht (vgl. die folgende Abbildung).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.         Nationale Qualitätssicherung der derzeit empfohlenen Rhesus-Typisierungsstrategie

 

Die Arbeitsgruppe wurde von der Deutschen Gesellschaft für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie mit der Führung des „Rhesus-Immunisierungs-Registers“ beauftragt. In diesem Register werden Fälle von Anti-D-Immunisierungen bei D-positiven Personen gesammelt und molekularbiologisch aufgeklärt. Ziel ist es, einen Überblick über mögliche Probleme bei der derzeitigen Transfusionsstrategie zu bekommen, und, falls erforderlich, Vorschläge für verbesserte Typisierungs- und Transfusionsstrategie zu erarbeiten. Bisher wurden keine Alloimmunisierungen bei Patienten mit häufigen weak D-Phänotypen beobachtet (siehe Abbildung).

 

 

Im Jahr 2002 konnte gezeigt werden, dass ein erheblicher Teil von Anti-D-Immunisierungen bei D-positiven Personen durch das Partial D DNB bedingt ist. Diese in Ulm entdeckte Partial D-Form ist offensichtlich das häufigste Partial-D zumindest in Zentraleuropa. Die derzeitige D-Typisierungsstrategie führt zu D-positiven Transfusionen bei Patienten mit DNB, was die wiederholt beobachteten anti-D-Immunisierungen erklärt. Möglichkeiten für verbesserte Typisierungsstrategien wurden evaluiert, eine kostenneutrale Lösung erscheint jedoch derzeit nicht möglich.

 

 

 

 

4.         Molekulare Basis von Blutgruppen-Systemen

 

Die Charakterisierung der molekularen Basis von neuen Blutgruppensystemen und bisher nicht zugeordneten Antigenen hat erhebliche grundlegende und praktische Bedeutung, da sie neue Einblicke in die Funktion der Proteine der Erythrozytenmembran zulässt und Voraussetzung für eine Genotypisierung ist. Im Rahmen eines anlaufenden Projektes wurde zunächst nachgewiesen, dass das Scianna-Blutgruppensystem auf Polymorphismen der ERMAP-Proteins beruht. Weiter wurde bewiesen, dass das bisher nicht zugeordnete Antigen Rd zum Scianna-Blutgruppensystem gehört (vgl. die folgende Abbildung).

 

Die Forschungsergebnisse erlaubten Einblicke in die Bedeutung und Funktion des ERMAP-Adhäsionsproteins durch den überraschenden Nachweis, dass ERMAP-Nullphänotypen klinisch weitgehend asymptomatisch bleiben.

 

 

 

 

 

 

5.         Entwicklung praxisgerechter Verfahren zur Genotypisierung von Blutgruppen

 

Die Aufklärung der molekularen Ursache der Blutgruppenantigene erlaubt im Prinzip deren Vorhersage aus der Nukleinsäure (DNA). Derartige Genotypisierungs-Verfahren sind serologischen Methoden in mehrerer Hinsicht überlegen: Es kann Material benutzt werden, dass für serologische Methoden ungeeignet ist (Fruchtwasser oder peripheres Blut der Mutter zur Bestimmung der Blutgruppe eines Föten), serologische Probleme (z. B. massive Transfusionen, Autoimmunhämolysen) beeinträchtigen die Aussagekraft nicht und die Empfindlichkeit für den Nachweis von klinisch relevanten schwachen Antigenen ist zum Teil dramatisch erhöht. Schließlich wird die Erkennung und Unterscheidung der Allele nicht durch das Fehlen geeigneter oder die Verwendung kostspieliger Antikörper eingeschränkt.

 

Von der Arbeitsgruppe werden regelmäßig PCR-Methoden zum einfachen Nachweis von Blutgruppenantigenen entwickelt (im Jahr 2002 beispielsweise für Sc1, Sc2, Rd, DAU). Solche Methoden sind für zahlreiche Blutgruppensysteme etabliert und werden fortlaufend gepflegt (Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, Dombrock, Colton). Da nachgewiesen werden konnte, dass sich einige Anti-D-Immunisierung bei Transfusionsempfängern durch PCR-Testung auf D hätten vermeiden lassen, wurde dieser Test in die Spendertypisierung integriert. Im Jahr 2000 wurde die molekulare Grundlage und der Mechanismus der unter Europäern weit verbreiteten Rhesus Deletion (als Ursache von Rhesus negativ) beschrieben, was erhebliche praktische Bedeutung zum Beispiel für die Schwangerschaftberatung hat (vgl. die folgende Abbildung).

 

Im Rahmen einer internationalen Kooperation sollen in den nächsten Jahren Verfahren zur verbesserten DNA-Typisierung entwickelt werden. Fernziel ist die Entwicklung praxisgängiger Methoden für die preiswerte Massen-Untersuchung, die eine Bestimmung der transfusionsrelevanten Antigene zulassen. Ein wesentlicher Anteil ist hierbei auch die Erfassung seltenerer Varianten in anderen Blutgruppensystemen. In diesem Rahmen wurde von der Arbeitsgruppe im Jahr 2002 ein klinisch relevantes, neues Colton-Allel beschrieben.

 

6.         Durchfluss-Zytometrie zur Beschreibung des Erythrozyten-Phänotyps

 

Die Untersuchung von Blutgruppenantigenen mittel Durchfluss-Zytometrie bietet gegenüber klassischen serologischen Verfahren den Vorteil einer direkten quantitativen Messung. Das Verfahren wurde von der Arbeitsgruppe weitgehend standardisiert und zum Nachweis unterschiedlicher Phänotypen für unterschiedliche Partial-D-Allele und weak-D-Allele benutzt. Diese Studien hatten erhebliche Auswirkungen, da sie das zuvor bestehende Dogma eines normalen D Antigens bei weak D widerlegten.

 

Im Rahmen einer internationalen Kooperation wurde die Reproduzierbarkeit des in Ulm gewählten Ansatzes im Rahmen eines von der Arbeitsgruppe koordinierten internationalen Workshops bestätigt. Es zeigte sich eine außerordentlich gute Übereinstimmung der zuvor bestimmten Antigendichten mit den weltweit reproduzierten (vgl. die folgende Abbildung).

 

Auch die qualitativen Veränderungen des D-Antigens konnten nachvollzogen werden. Derzeit wird im Rahmen eines Promotionsverfahrens eine Ausweitung der Methode auf andere Proteine der Erythrozyten-Membran evaluiert.

 

 

Projektbezogene Drittmittel

 

Stiftung der DGTI , Sachkostenbeihilfe DGTI/fle/00-01 „Rhesusprojekt“

 

 

Publikationen der letzten 5 Jahre (1997 bis 2002 einschließlich)

 

Originalarbeiten

1.         Wagner, F.F., Poole, J., Flegel, W.A.: The Scianna antigens including Rd are expressed by ERMAP. Blood 2002, zur Veröffentlichung angenommen

2.         Wagner, F.F., Eicher, N.I., Jørgensen, J.R., Lonicer, C.B., Flegel, W.A.: DNB: a partial D with anti-D frequent in Central Europe. Blood 2002 im Druck

3.         Wagner, F.F., Ladewig, B., Angert, K.S., Heymann, G.A., Eicher, N.I., Flegel, W.A.: The DAU allele cluster of the RHD gene. Blood 100: 306 – 311, 2002

4.         Flegel, W.A., Čurin-Šerbec, V., Delamaire, M., Donvito, B., Ikeda, H., Jørgensen, J., Kumpel, B., Le Pennec, P.-Y., Písačka, M., Tani, Y., Uchikawa, M., Wendel, S., Wagner, F. F.: Rhesus index and antigen density: An analysis of the reproducibility of flow cytometric determination (Section 1B: Rh flow cytometry – Coordinator’s report). Transf. Clin. Biol. 9: 33 – 42, 2002

5.         Joshi, S.R., Wagner, F.F., Vasantha, K., Panjwani, S., Flegel, W.A.: An AQP1 null allele in an Indian woman with Co(a-b-) phenotype and high-titer anti-Co3 associated with mild HDN. Transfusion 41: 1273 – 1278, 2001

6.         Wagner, F.F., Ernst, M., Sonneborn, H.-H., Flegel, W.A.: A DV-like phenotype is obliterated by A226P in the partial D DBS. Transfusion 41: 1052 – 1058, 2001

7.         Wagner, F.F., Frohmajer, A., Flegel, W.A.: RHD positive alleles in D negative whites. BMC Genetics 2: 10, 2001

8.         Wagner, T., Vadon, M., Staudacher, E., Schmarda, A., Gassner, C., Helmberg, W., Lanzer, G., Flegel, W.A., Wagner, F.F.: A new h allele detected in Europe has a missense mutation in a(1,2)-fucosyltransferase motif II. Transfusion 41, 31 - 38, 2001

9.         Wagner, F.F., Flegel, W.A.: RHD gene deletion occurred in the Rhesus box. Blood 95: 3662 - 3668, 2000

10.      Wagner, F.F., Frohmajer, A., Ladewig, B., Eicher, N.I., Lonicer, C.B., Müller, T.H., Siegel, M.H., Flegel, W.A.: Weak D alleles express distinct phenotypes. Blood 95: 2699 - 2708, 2000

11.      Flegel, W.A., Khull, S.R., Wagner, F.F.: Primary anti-D immunization by weak D type 2 RBCs. Transfusion 40: 428 - 424, 2000

12.      Flegel, W.A., Besenfelder, W., Wagner, F.F.: Predicting a donor´s likelihood of donating within a preselected time interval. Transfusion Medicine 10: 181 - 192, 2000

13.      Willy, C., Reithmeier, W., Kuhlmann, W.D., Gerngross, H., Flegel, W.A.: Leukocyte depletion of red cell components prevents exposure of transfusion recipients to neutrophil elastase. Vox Sang. 78: 19 - 27, 2000

14.      Wagner, F.F., Gassner, C., Müller, T.H., Schönitzer, D., Schunter, F., Flegel, W.A.: Molecular basis of weak D phenotypes. Blood 93: 385 - 393, 1999

15.      Wagner, F.F., Gassner, C., Müller, T.H., Schönitzer, D., Schunter, F., Flegel, W.A.: Three molecular structures cause Rhesus D category VI phenotypes with distinct immunohematologic features. Blood 91: 2157 - 2168, 1998

16.      Wagner, F.F., Flegel, W.A.: Polymorphism of the h allele and the population frequency of non-functional alleles. Transfusion 37: 284 - 290, 1997

 

Koauthorenschaft in Originalarbeiten

1.         Müller, T.N., Wagner, F.F., Trockenbacher, A., Eicher, N.I., Flegel, W.A., Schönitzer, D., Schunter, F., Gassner, C.: PCR screening for common weak D types shows different distributions in three Central European populations. Transfusion 41, 45 - 52, 2001

2.         Wellinghausen, N., Jochle, W., Reuter, S., Flegel, W.A., Grunert, A., Kern, P.: Zinc status in patients with alveolar echinococcosis is related to disease progression. Parasite Immunol. 21, 237 – 241, 1999

3.         Romig, T., Kratzer, W., Kimmig, P., Frosch, M., Gaus, W., Flegel, W.A., Gottstein, B., Lucius, R., Beckh, K., Kern, P.: An epidemiologic survey of human alveolar echinococcosis in southwestern Germany. Am. J. Trop. Med. Hyg. 61, 566 – 573, 1999

4.         Moulds, J.M., Blanchard, D., Daniels, G., Flegel, W.A., Hadley, A., Medof, M.E., Ribera, A.: Coordinator´s report: complement regulatory proteins. Transfus. Clin. Biol. 4: 117-119, 1997

5.         Avent, N.D., Jones, J.W., Liu, W., Scott, M.L., Voak, D., Flegel, W.A., Wagner, F.F., Green, C.: Molecular basis of the D variant DNU and DII allows localization of critical amino acids required for expression of the Rh D epitopes epD3, 4 and 9 to the sixth external domain of the Rh D protein. Brit. J. Haematol. 97, 366 - 371, 1997

6.         Gassner, C., Schmarda, A., Kilga-Nogler, S., Jenny-Feldkircher, B., Rainer, E., Müller, T. H., Wagner, F.F., Flegel, W.A., Schönitzer, D.: Rhesus D/CE genotyping by polymerase chain reaction using sequence specific primers. Transfusion 37: 1020-1026, 1997

 

Monographien, Lehrbuchbeiträge und Dissertationen

1.         Lippert, H.-D., Flegel, W.A.: Kommentar zum Transfusionsgesetz (TFG) und den Hämotherapie-Richtlinien. XXXIX, 521 Seiten gebunden. Springer, Berlin, 2002. ISBN 2-540-41816-4

2.         Witter, B.: Die Verteilung von Antigendichten und weak D-Allelen im Rhesusphänotyp ccD.Ee. Dissertation, Universität Ulm 2000

3.         Flegel, W.A.: Transfusion. In: Delves, P.J., Roitt, I.M. (Eds.) Encyclopedia of Immunology. Academic Press, London, 2nd Edition 1999

4.                  Northoff, H., Flegel, W.A.: Foetal Calf Serum. In: Delves, P.J., Roitt, I.M. (Eds.) Encyclopedia of Immunology. Academic Press, London, 2nd Edition 1999

5.         Wagner, F.F.: Die molekulare Basis der RH-Haplotypen mit schwacher Expression des Antigens D. Habilitationsschrift, Universität Ulm 1999
6.         Frohmajer, A.: Häufigkeit nicht-funktionaler Allele des RHD-Gens und Ursachen der fehlenden Antigen-Expression. Dissertation, Universität Ulm 1999
7.         Kubanek, B., Wagner, F.: Substitutionstherapie bei onkologischen Erkrankungen. In: Ostendorf, P.C., Seeber, S. (Hrsg.) Hämatologie Onkologie, Urban & Schwarzenberg, München 1997
8.         Flegel, W.A.: Häufigkeit sporadischer nicht-funktionaler Allele und ihre Bedeutung für die Genotypisierung am Beispiel des Polymorphismus im FUT1-Blutgruppengen. Habilitationsschrift, Universität Ulm 1997

9.         Flegel, W.A, Wagner, F.F.: Blutgruppen von Erythrozyten. In: Müller-Eckhardt, C., Kiefel, V. (Hrsg.) Transfusionsmedizin. Springer, Berlin, in Vorbereitung.

10.      Wagner, F.F., Kubanek B.: Therapie mit Erythrozyten. In: Müller-Eckhardt, C, Kiefel, V. (Hrsg.) Transfusionsmedizin. Springer, Berlin, in Vorbereitung.

 

Leserzuschriften, Übersichtsarbeiten, ausführliche veröffentlichte Kongressbeiträge und Übersetzungen eigener Arbeiten:

1.         Wagner, F.F., Flegel, W.A.: RHCE represents the ancestral RH position, while RHD is the duplicated gene. Blood 99: 2272 – 2273, 2002

2.         Flegel, W. A., Wagner, F. F.: Molekularbiologie von partial D und weak D: Bedeutung für die Praxis in der Blutzentrale (Übersetzung). MTA Dialog 8: 662 – 665, 2002

3.         Flegel, W. A., Wagner, F. F.: Characterization of antibodies against Rh complex, RhcE and Rh50 antigens. In: D. Mason (Ed.) Leucocyte Typing VII. Seiten 596 – 598. Oxford University Press, Oxford, 2002

4.         Flegel, W. A., Wagner, F. F.: Characterization of antibodies against the Rhesus D antigen using red blood cells expressing Rhesus protein variants. In: D. Mason (Ed.) Leucocyte Typing VII. Seiten 598 – 600. Oxford University Press, Oxford, 2002

5.         Flegel, W. A., Wagner, F. F.: Molecular biology of partial D and weak D: implications for blood bank practice (reprinted with modifications). Clin. Lab. 48: 53 – 59, 2002

6.         Nowak-Harnau, S., Wagner, F.F., Flegel, W.A.: Completely converting a national blood supply to the use of safer plasma. Transfusion 41: 1172 - 1173, 2001

7.         Flegel, W.A.: Molecular biology of partial D and weak D: implications for blood bank practice. In: 54th Annual Meeting and Transfusion Expo. American Association of Blood Banks, Arlington PA, 2001 (CD-ROM)

8.         Flegel, W.A., Wagner, F.F.: Molecular genetics of RH. Vox Sang. 78(suppl 2): 109 - 114, 2000

9.         Legler, T.J., Kroll, H., Wagner, F.F., Flegel, W.A., Hallensleben, M.: Indikationen zur Genotypisierung erythrozytärer und thrombozytärer Antigene (Consensus Statement). Infusionsther Transfusionsmed 27: 215 - 216, 2000

10.      von Kiparski, S., Northoff, H., Flegel, W.A., Neumeister, B.: Rh blood group antigens – update. Clin. Lab. 46: 17 – 22, 2000

11.      Northoff, H., Flegel, W.A.: Genotyping and phenotyping: the two sides of one coin. Infusionsther. Transfusionsmed. 26: 5, 1999

12.      Flegel, W.A.: Quality of platelet concentrates. Transfusion 38: 799-800, 1998

13.      Wagner, F.F., Flegel, W.A.: Principles and applications of red cell flow cytometry. Infusionsther Transfusionsmed. 25: 342 – 346, 1998

14.      Flegel, W.A., Northoff, H., Wagner, F.F.: Rhesus D-Bestimmung beim Transfusionsempfänger. mta Zeitschr 13: 83 - 87, 1998

15.      Wagner, F.F., Flegel, W.A., Kubanek, B.: Blood transfusion: influence of transfusion therapy on outcome. Curr. Opin. Anaesthesiol. 11: 167 - 175, 1998

16.      Flegel, W.A., Wagner, F.F., Müller, T.H., Gassner, C.: Rh phenotype prediction by DNA typing and its application to practice (eingeladene Übersichtsarbeit). Transfus. Med. 8: 281 - 302, 1998

17.      Wagner, F.F., Flegel, W.A.: Analysis by flow cytometry of chimerism after bone marrow transplantation and of erythrocyte antigen density. In: Gutensohn, K., Sonneborn, H.-H., Kühnl, P. (Eds.) Aspects of the Flow-Cytometric Analysis of Red Blood Cells. Clin Lab Publications, 1997

 

 

Wissenschaftliche Tagungen

 

Seminar: Molecular biology of partial D and weak D: implications for blood bank practice. 54th Annual Meeting, American Association of Blood Banks. 16.10.2001, San Antonio, TX, USA

Vorsitz: RBC: RH – Molecular Studies. 54th Annual Meeting, American Association of Blood Banks. 15.10.2001, San Antonio, TX, USA

Sektionskoordinator und Vorsitz: Antibodies to RH: Flow cytometry, Workshop Session 1B. 4th International Workshop and Symposium on Monoclonal Antibodies against Human Red Blood Cells and Related Antigens. 19.7.2001, Paris, Frankreich

Vorsitz: Carbohydrate and protein blood group antigens. VII European Congress of the International Society of Blood Transfusion (ISBT) . 16.7.2001, Paris, Frankreich

Vorsitz: Flow cytometry. XXVIth Congress of the International Society of Blood Transfusion (ISBT). 12.7.2000, Wien

 

Stand: 20.08.2002